玉屏风散对小鼠β防御素-2基因表达的影响

研究玉屏风散益气固表、提高机体对环境病因抵抗力的机理。实验组6只小鼠以玉屏风散水煎液灌胃10 d,对照组6只小鼠给予同体积生理盐水,处死动物后提取肺组织总RNA,通过实时荧光定量PCR测定小鼠在灌服玉屏风散水煎液后β防御素-2基因表达水平。结果实验组小鼠β防御素-2基因的相对表达量是对照组的9.327倍。表明玉屏风散增强机体抵抗力与其可上调β防御素-2基因的表达从而提高机体非特异性免疫力有关。     

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。     

Intralesional bovine papillomavirus DNA loads reflect severity of equine sarcoid disease

Reasons for performing study: Sarcoids are nonmetastasising, yet locally aggressive skin tumours that constitute the most frequent neoplasm in equids. Infection by bovine papillomaviruses types 1 and 2 (BPV‐1, BPV‐2) has been recognised as major causative factor in sarcoid pathogenesis, but a possible correlation of intralesional virus load with disease severity has not been established thus far. Hypothesis: Given the pathogenic role of BPV‐1 and BPV‐2 in sarcoid disease, we suggest that intralesional viral DNA concentration may reflect the degree of affection. Methods: Severity of disease was addressed by recording the tumour growth kinetics, lesion number and tumour type for 37 sarcoid‐bearing horses and one donkey. Viral load was estimated via quantitative real‐time PCR (qPCR) of the E2, E5, L1 and L2 genes from the BPV‐1/‐2 genome for one randomly selected lesion per horse and correlated with disease severity. Results: Quantitative PCR against E2 identified viral DNA concentrations ranging from 0–556 copies/tumour cell. Of 16 horses affected by quiescent, slowly growing single tumours or multiple mild‐type lesions, 15 showed a viral load up to 1.4 copies per cell. In stark contrast, all equids (22/22) bearing rapidly growing and/or multiple aggressive sarcoids had a viral load between 3 and 569 copies per cell. Consistent results were obtained with qPCR against E5, L1 and L2. Conclusions: While tumours of the same clinical type carried variable virus load, confirming that viral titre does not determine clinical appearance, we identified a highly significant correlation between intralesional viral load and disease severity. Potential relevance: The rapid determination of BPV viral load will give a reliable marker for disease severity and may also be considered when establishing a therapeutic strategy.     

家蚕经菊酯类农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱及烯醇酶基因的组织转录活性

为了从蛋白质水平探讨家蚕对菊酯类农药的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,分析家蚕5龄幼虫经氯氰菊酯诱导前后脂肪体蛋白的表达特征。采用ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到432个蛋白点,诱导实验组检测到369个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有342对,匹配率为76.68%。对特征蛋白进行MALDI-TOF-MS分析鉴定的蛋白包括烯醇酶、线粒体醛脱氢酶、伴侣素、肌动蛋白、gag-like蛋白。烯醇酶(enolase)是糖酵解过程中极为重要的酶类。采用半定量RT-PCR对经氯氰菊酯诱导后的家蚕脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等7个组织器官的烯醇酶基因进行表达分析,结果表明,烯醇酶基因转录水平在7个组织器官中都呈现下调趋势,分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%,其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。受菊酯类农药诱导的影响,家蚕5龄幼虫脂肪体蛋白的数目减少,烯醇酶基因在各组织器官减量表达,提示可能与蚕体的基础生理代谢受到抑制有关。     

梅山猪垂体中GH、PRL及TSHβ基因发育性表达规律的研究

生长激素(GH)、催乳素(PRL)及促甲状腺激素β亚基(TSHβ)是动物生长发育过程中的重要调控因子。本研究我们通过RT-PCR检测了GH、PRL及TSHβ基因在不同生长阶段梅山猪垂体中mRNA的表达水平。结果发现:GH和TSHβ基因在公、母猪的生长发育过程中的表达量总体上都呈现先升高后降低的趋势;而PRL在公猪中的表达量在不同发育阶段相对稳定,而在母猪中呈现先下降后升高的趋势。总体上GH、PRL及TSHβ3个基因在公、母猪的生长发育过程中的表达呈现性别二相性。其中GH基因的表达在1、30、90和150日龄公、母猪间呈现出显著差异(P0.05);而PRL基因的表达在1、60和90日龄的公、母猪表现显著差异(P0.05);而TSHβ基因的表达在60和150日龄的公、母猪表现显著差异(P0.05)。     

枳SPL9和SPL13全长cDNA克隆、亚细胞定位和表达分析

【目的】从枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]中克隆SBP类[SQUAMOSA(SQUA)promoter-binding-like]转录因子基因SPL9和SPL13全长,构建SPL9和SPL13亚细胞定位表达载体验证其是否具有核定位功能,利用荧光定量PCR研究其在枳不同组织的表达特性,初步确定SPL9和SPL13在枳生长发育过程中的作用。【方法】利用生物信息学结合RACE技术以枳花器官的cDNA为模板,克隆出SPL9和SPL13基因全长,分别命名Pt-SPL9和Pt-SPL13,大小分别是1519bp和1824bp,在GenBank的登录号分别是FJ502237和FJ502238;构建Pt-SPL9和Pt-SPL13亚细胞定位载体35S-GW-FJ502237/FJ502238-GFP,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24h后激光共聚焦显微镜下观察;利用SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测Pt-SPL9和Pt-SPL13在根、茎、叶、花序、花和果等不同组织中的表达。【结果】生物信息学分析表明,Pt-SPL9和Pt-SPL13的cDNA序列中都有microRNA156的识别位点,Pt-SPL9与金鱼草、拟南芥和玉米SPL9的同源性分别为48.9%、42.5%和41.7%;Pt-SPL13与拟南芥SPL13、水稻的SPL16和玉米的TGA1同源性分别为40.8%、38.1%和35.8%。Pt-SPL9和Pt-SPL13与其它植物的SBP一样有着高度保守的序列,即SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。亚细胞定位结果表明,Pt-SPL9和Pt-SPL13均定位于细胞核中。SYBR Green I实时定量RT-PCR结果表明,Pt-SPL9和Pt-SPL13在各个器官均有表达,但表达量不同,Pt-SPL9在茎中的表达量最高,在花和叶中的表达量次之,在根、花芽和幼果中的表达量最低;Pt-SPL13在幼果中的表达量最高,在茎和花芽中的表达量相当,其次为叶,在花和根中的表达量很低。【结论】转录因子Pt-SPL9和Pt-SPL13均具有核定位功能,Pt-SPL9和Pt-SPL13对枳的茎和果实的发育可能有着重要作用。     

水稻抽穗期4个异交相关性状对外源GA3的敏感性及其QTLs定位

以98个家系组成的Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系(BIL)及其亲本为遗传材料,利用复合区间作图方法(CIM)在两个环境下研究了水稻抽穗期4个异交性状对外源GA3处理的敏感性及其QTLs定位。结果表明:两个环境下BIL群体4个异交性状GA3处理值较对照显著增加。最上节间长度反应指数在两个生长环境中共检测到3个QTLs,分别位于第1、3、11染色体上,对GA3敏感的等位基因分别来自Kasalath、Kasalath、Nipponbare,解释表型变异的7.70%～13.77%。柱头外露率反应指数共检测到2个QTLs,分别位于第2和第7染色体上,对GA3敏感的等位基因分别来自Nipponbare和Kasalath,解释表型变异的14.17%和20.58%。小花开花历时反应指数在两个生长环境中检测到1个QTL,位于第11染色体上,对GA3敏感的等位基因来自Kasalath,解释表型变异的10.76%。开颖角度反应指数共检测到2个QTLs,分别位于第1和第7染色体上,对GA3敏感的等位基因分别来自Nipponbare和Kasalath,解释表型变异的9.42%和14.17%...     

草原红牛不同组织雄激素受体基因表达量检测及比较研究

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测雄激素受体基因(Androgen receptor gene,AR)在草原红牛公牛和母牛多种组织中的表达情况,探讨该基因在草原红牛公牛和母牛不同组织中的表达差异.结果表明,AR基因在所检测的公牛和母牛的心、肝、脾、肺、肾、肠、胃及睾丸(卵巢)等8种组织中均有表达,且肝脏中的表达量高于其他组织;草原红牛公牛和母牛相同组织闻比较结果显示:AR基因在草原红牛公牛肝脏中表达量与母牛相比较差异不显著,其他不同组织间表达量均有显著差异(P<0.05),且公牛各组织中的表达量均高于母牛.本试验为深入研究AR基因的生物学功能及了解该基因对不同性别个体肉质性状的形成的作用机制奠定了基础.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量

为建立一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5′端非编码区设计1对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其他猪源病毒发生非特异性反应。应用实时荧光定量RT-PCR法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明,102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在107~102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感性、特异性、重复性好等优点,可望取代传统的兔热法用于猪瘟疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新的有效工具。     

实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒J亚群

将禽白血病病毒J亚群(ALV-J)NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组,采用实时荧光定量RT-PCR方法,定期检测病毒在体内的复制情况。根据GenBank发表的ALV-Jenv基因保守序列(AY897227)设计1对特异性引物扩增目的基因;根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458),在保守区内设计1对引物扩增内参照基因,分别克隆入质粒作为标准品制作标准曲线,采用SYBR GreenⅠ染料建立荧光定量PCR法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系;最低每个反应可检测到60个拷贝的病毒数,比常规PCR灵敏度高1 000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析,都达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现,在雏鸡4周龄时,2个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J病毒在体内经过3~4周潜伏后,突然呈暴发式增长,这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关。结果表明,本试验建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法,为进一步相关研究奠定了基础。